我國首例非洲豬瘟的確診

王清華 1，任煒杰 1，包靜月 1，戈勝強 1，李金明 1，李 林 1，樊曉旭 1，劉春菊 1，王 華 1，永強 1，徐天剛 1，吳曉東 1，段亞良 2，顧貴波 2，周晨陽 2

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，國家外來動物疫病研究中心，山東青島 266032；2. 遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽 110164）

摘 要 ：近日，遼寧省沈陽市一養(yǎng)豬戶飼養(yǎng)的豬陸續(xù)發(fā)生不明原因死亡，病死豬剖檢發(fā)現(xiàn)脾臟異常腫大，疑似非洲豬瘟病毒感染。經(jīng)國家外來動物疫病研究中心檢測，確診為非洲豬瘟病毒核酸陽性，B646L/p72 基因序列417 個堿基與俄羅斯毒株 100% 匹配，與俄羅斯和東歐目前流行的格魯吉亞毒株（Georgia 2007）屬于同一進化分支。這是我國發(fā)現(xiàn)的首例非洲豬瘟，疫情來源有待進一步調(diào)查。關(guān)鍵詞 ：非洲豬瘟 ；非洲豬瘟病毒 ；熒光定量 PCR ；普通 PCR ；ASFV 特異性抗體中圖分類號 ：S852.65 文獻標(biāo)識碼 ：A

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus， ASFV）引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性動物傳染病， 臨床上以高熱、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)出血和高死亡率為特征，易感豬群的病死率高達 100%。鑒于該病的嚴(yán)重危害性，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。ASFV 不感染人，對人的健康不構(gòu)成威脅。目前， 針對 ASF 防控，尚無有效的商品化疫苗。

2018 年 8 月 1 日，國家外來動物疫病研究中心接到遼寧省沈陽市沈北區(qū)發(fā)現(xiàn) ASF 臨床可疑病例的報告（圖 1）。截至 8 月 1 日，發(fā)病豬場累計死亡 47 頭，對剛病死的 2 頭豬剖檢發(fā)現(xiàn)：脾臟極度腫大，嚴(yán)重梗死，質(zhì)脆易碎，其中一頭豬脾腫大至少 10 倍，一頭豬脾腫大 5~7 倍；肺出血、質(zhì)硬，有間質(zhì)性肺炎變化；下頜淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)出血，切面呈大理石樣變；胃漿膜面彌漫性出血；腎腫脹明顯、色淡，未見出血點；扁桃體見陳舊性出血，符合 ASF 癥狀。國家外來動物疫病研究中心立即開展病原學(xué)檢測，證實本次疫情由ASFV 引起。這是我國歷史上的首次 ASF 發(fā)病記錄。

1 材料與方法

1.1 病料

病原學(xué)樣品：分別來源于 2 頭病死豬的剖檢病料，包括全血、脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體；30 頭臨床健康豬的全血。

血清樣品：2 頭病死豬及同群 30 頭臨床健康豬血清。

1.2 病料 DNA 提取

在加有陶珠的組織勻漿管（Roche）中，加入600 μL PBS 緩沖液，再加入剪碎的組織樣品約 30mg，使用 HyBaid RiboLyser 組織勻漿機進行勻漿處理。取 200 μL 組織勻漿液和全血，分別使用病毒 DNA 提取試劑盒提取 DNA。最后將提取的核酸于 ?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?

1.3 熒光定量 PCR

依據(jù)文獻報道 [1]，用本實驗室建立的 OIE 推薦的 ASFV 特異的熒光定量 PCR 方法進行 ASFVp72 基因片段的擴增。ASFV 特異性引物為 king-s/ king-a，TaqMan 探針為 ASFVP，同時以本試驗室合成的質(zhì)粒 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對照。

1.4 普通 PCR

依據(jù)文獻報道 [2]，用本實驗室建立的 OIE 推薦的 ASFV 特異的 PCR 方法進行 ASFV p72 基因片段的擴增。ASFV 特異性引物為 PPA1/PPA2，產(chǎn)物長度為 257 bp，同時以本試驗室合成的質(zhì)粒DNA 標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對照。

1.5 測序片段 PCR 擴增

依據(jù)文獻報道 [3-4]，合成擴增 p72 基因分型的通用型引物（p72-D/p72-U）。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。采用高保真的Phusion High- Fidelity PCR Master Mix 擴增B646L/p72 基因片段， 預(yù)期擴增片段大小 478 bp。50 μL 的 PCR 反應(yīng)體系 為 ：2X Phusion Master Mix 25 μL，p72-D（10μmol/L） 和 p72-U（10 μmol/L） 各 2 μL， 模 板DNA 2 μL，用滅菌水補齊體積至 50 μL。PCR 反應(yīng)程序為：98 ℃預(yù)變性 30 s；然后進行 35 個 PCR 循環(huán)（98 ℃ 10 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）；最后 72℃ 10 min。

1.6 PCR 產(chǎn)物測定

擴增產(chǎn)物使用 1% 的瓊脂糖凝膠電泳，然后切膠回收， 對回收的 DNA 直接用于測序。序列 拼 接 采 用 Lasergene 7.1 軟 件（DNASTAR Inc.Madison，WI，USA） 中 的 EditSeq 與 MegAlign 模塊。多序列的比對和遺傳進化樹的繪制，應(yīng)用MEGA 5.0 軟件進行。其他國家的參考毒株序列從GenBank 中獲得。

1.7 抗體檢測

西班牙 INGENASA 公司生產(chǎn)的非洲豬瘟阻斷 ELISA 抗體檢測試劑盒，批號為 050218。法國ID-vet 公司生產(chǎn)的非洲豬瘟間接 ELISA 抗體檢測試劑盒，批號為 B71。國家外來動物疫病研究中心自主研發(fā)的非洲豬瘟間接 ELISA 試劑盒，批號為 201801。INGENASA 公司生產(chǎn)的非洲豬瘟阻斷ELISA 試劑盒包被抗原為 p72 蛋白，IDvet 公司生產(chǎn)的非洲豬瘟間接ELISA 試劑盒包被抗原為p30、p62、p72 重組蛋白， 自主研發(fā)的非洲豬瘟間接ELISA 試劑盒包被抗原為 p30 蛋白。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量 PCR

熒光定量 PCR 檢測結(jié)果顯示，采自 2 只病死豬的 8 份組織樣品和全血中都能檢測到ASFV 特異性擴增曲線，Ct 值為 19.14~26.5（圖 2）。

擴增曲線的橫坐標(biāo)為擴增循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光強度；綠色橫線位置為熒光強度的閾值，對應(yīng)的循環(huán)數(shù)為臨界循環(huán)數(shù)（CT）；CT 值低于 40 判定為陽性；圖中擴增曲線從左至右依次為P、全血 1、脾 1、全血 2、淋巴結(jié) 2、腎 2、淋巴結(jié) 1、腎 1、脾 2

2.2普通 PCR

ASFV 普通PCR 擴增結(jié)果顯示，7 個樣本（分別為全血 1、淋巴結(jié) 1、腎 1、脾 1、全血 2、淋巴結(jié) 2、腎 2）在 257 bp 左右有特異性擴增條帶，與陽性對照一致（圖 3）。樣本脾 2 特異性擴增條帶較弱。

1~8. 全血 1、淋巴結(jié) 1、腎 1、脾 1、全血 2、淋巴結(jié) 2、腎 2、脾2；P. 陽性對照；N. 陰性對照；M. 分子量標(biāo)記（由上至下分別為2000、1000、750、500、250、100 bp

2.3 p72 基因片段序列遺傳進化分析

對樣本 B646L/p72 基因片段普通 PCR 產(chǎn)物進行正反向測序，對得到的序列進行拼接后獲得 p72基因片斷序列，長度為 417 bp（圖 4）。對擴增的P72 基因序列，應(yīng)用鄰接法（Neighbor-joining）繪制了遺傳發(fā)生樹（圖 5）。結(jié)果顯示，該樣本病毒屬于基因 II 型，與目前在俄羅斯和東歐流行的格魯吉亞毒株（Georgia 2007）同屬于一個進化分支。

2.4 抗體檢測

對 32 份血清樣品的 ASFV 特異性抗體檢測結(jié)果均為陰性。

3 討論

ASFV 是非洲豬瘟病毒科（Asfarviridae） 非洲豬瘟病毒屬的唯一成員， 基因組為雙股線狀DNA，大小為 170~190 kb。根據(jù)病毒編碼主要衣殼蛋白 p72 的 B646L 基因，可將該病分為 24 個與地域性相關(guān)的基因型 [5-6]?；?II 型流行于非洲東南部，2007 年傳至格魯吉亞，并擴散到俄羅斯聯(lián)邦和東歐地區(qū) [7]，已在高加索地區(qū)定殖；2017 年，該基因型病毒向東長距離跨越式傳播至俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)伊爾庫茨克 [9]，導(dǎo)致傳入我國的風(fēng)險空前升高。目前，ASF 已經(jīng)成為困擾歐洲養(yǎng)豬業(yè)的一個重要問題 [8]。該病跨國界傳播能力和危害性使其成為全球性的問題。

本次疫情是我國確診的首例非洲豬瘟。該豬場生物安全條件較差，緊臨車輛繁忙的鄉(xiāng)間公路， 場區(qū)出入口無消毒池。病死豬在當(dāng)?shù)孬F醫(yī)部門監(jiān)督下就近掩埋處理，有相應(yīng)的生豬保險理賠記錄。剩余存欄生豬 336 頭，臨床未見異常。據(jù)了解，死亡豬多為 100 kg 的大豬。p72 基因片段遺傳進化分析顯示，本次暴發(fā)流行的毒株為基因 II 型，與俄羅斯及東歐流行的毒株屬同一分支，提示疫情可能來自俄羅斯和東歐疫情國家。為進一步確定病毒與俄羅斯和東歐流行株的差異，正在對全基因組序列進行分析。值得注意的是，該起疫情的病死率雖然很高（100%），但發(fā)病率和死亡率較低，發(fā)病高峰期 10 頭左右，平常日均死亡 3 頭左右。此外，同群豬臨床健康，隨機采集 30 頭豬的抗凝血、血清樣品的病原學(xué)檢測結(jié)果和血清學(xué)檢測結(jié)果均為陰性，提示該起疫情毒株的群內(nèi)傳播能力或有一定局限性。

感染生豬及其產(chǎn)品的移動是導(dǎo)致疫情快速遠(yuǎn)距離傳播的主要途徑。尤其值得注意的是，ASFV 在未經(jīng)高溫處理的肉品中存活能力很強，未經(jīng)高溫處理的泔水、煙熏肉、風(fēng)干肉、腌肉、火腿等也是造成病毒跨區(qū)域傳播的重要因素。歷史上，多起跨境傳播的 ASF 疫情與航空器、列車運載上述豬肉制品的處理不當(dāng)、感染ASF 野豬移動有關(guān)[10]。目前， 應(yīng)加強流行病學(xué)調(diào)查和主動監(jiān)測排查工作，特別對病死豬的檢測，應(yīng)重點關(guān)注屠宰場、病死生豬無害化處理場等高風(fēng)險場點，對已發(fā)現(xiàn)的確診病例要做進一步追溯排查；加大科普宣傳，發(fā)動養(yǎng)豬戶、診療人員和相關(guān)從業(yè)人員主動上報可疑情況。若發(fā)生疫情，應(yīng)嚴(yán)格按照《非洲豬瘟疫情應(yīng)急預(yù)案》和《非洲豬瘟防治技術(shù)規(guī)范》進行處置。

致謝：

中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心王志亮總獸醫(yī)師在疫情調(diào)查和檢測分析過程中給予悉心指導(dǎo)，遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心積極協(xié)助調(diào)查并提供樣品。

參考文獻：

[1] KING D P，REID S M，HUTCHINGS G H， et al. Development of a TaqMan PCR assay with internal ampli?cation control for the detection of African swine fever virus[J]. Journal of virology methods，2003，107（1）：53-61.

[2] AGUERO M，F(xiàn)ERNANDEZ J，ROMEROL，et al. Highly sensitive PCR assay for routine diagnosis of African swine fever virus in clinical samples[J]. Journal of clinical microbiology， 2003，41（9）：4431-4434.

[3] BASTOS A D，PENRITH M L，CRUCIERE C，et al. Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterisation[J]. Archives of virology，2003，148（4）：693- 706.

[4] LUBISI B A，BASTOS A D，DWARKA R M， et al. Molecular epidemiology of African swine fever in East Africa[J]. Archives of virology， 2005，150（12）：2439-2452.

[5] ACHENBACH J E，GALLARDO C，NIETO-PELEGRIN E，et al. Identification of a new genotype of African swine fever virus in domestic pigs from Ethiopia[J]. Transboundary emerging disease，2017，64（5）：1393-1404.

[6] QUEMBO C J， JORI F， VOSLOO W，et al. Genetic characterization of African swine fever virus isolates from soft ticks at the wildlife/domestic interface in Mozambique and identification of a novel genotype[J]. Transboundary emerging disease，2018，65（2）： 420-431.

[7] GALINDO I，ALONSO C. African swine fevervirus： a review[J]. Viruses，2017，9（5）.

[8] SANCHEZ-CORDON P J，MONTOYA M， REIS A L，et al. African swine fever： A re- emerging viral disease threatening the global pig industry[J]. Journal of veterinary medical science，2018，233：41-48.

[9] KOLBASOV D，TITOV I，TSYBANOV S，et al. African swine fever virus，Siberia，Russia， 2017[J]. Emerging infectious disease，2018，24（4）：796-798.

[10] BROWN V R，BEVINS S N. A review of African swine fever and the potential for introduction into the United States and the possibility of subsequent establishment in feral swine and native ticks[J]. Frontiers in veterinary science，2018，5：11.